تجارب تحليل عينات المياه بكتريولوجيا

تجارب تحليل عينات المياه بكتريولوجيا

لمزيد من المعلومات 

اشترك هنـــــــــــا

اولا جمع العينات

1)تجمع العينات فى زجاجيات بلاستيكية معقمة  

2)يزال الكلور منها بواسطة 0.1 مل من  محلول    Na2­S2O3   3%  فى زجاجة 120 مللى

 وهذه كافية لإزالة 5 مجم /لتر من الكلور 

3) لو لم يمكن تحليل العينة فى غضون ساعة من أخذها تحفظ العينة فى درجة حرارة أقل  10 درجات مئوية بواسطة الثلج لمدة 30 ساعة إذا كان التحليل خاص بالبكتيريا القولونية  ولمدة  8 ساعات إذا كان التحليل خاص بـ heterotrophic plate count

طرق الكشف السريع عن وجود البكتريا

أسهل الطرق هو

اختبار السبع ساعات للبكتريا القولونية البرازية Seven hours Fecal Coliform test

الوسط: M-7 h FC agar

 

نسخن المكونات فى حمام مائى وبعد أن تذوب المكونات نكمل تسخينها حتى 5 دقائق نبرد الى حوالى 55-50 س

نضبط الـ PH على 7.3 بواسطة (N 0.1)  NaOH ( حوالى 0.35 مل/لتر)

خطوات التجربة :

ناخذ كمية مناسبة  من العينة ونرشحها بواسطة  membrane filter    ثم نضعه على طبق يحتوى على الوسط الغذائى M-7 h FC agar   مع ملاحظة عدم وجود أى فراغات بين الوسط الغذائى والفلتر  ونضعها فى الحضانة لمدة 7 ساعات   لو ظهر لون أصفر يدل على وجود البكتريا القولونية البرازية (حدث تخمر للاكتوز)

طريقة عد البكتيريا غير ذاتية التغذية :

وتسمى  طريقة العد القياسية بواسطة الطبق  ووحدة القياس هى cfu   وهى اختصار جملة              

colony forming units"  ,

 أشهر الاوساط الغذائية :

1)  "plate count agar "  أو "trptose glycose yeast agar"  واختصاره "TGY "

وهذا الوسط الغذائى يصلح        لكل من طريقتى pour plate count and spread plate count

2)R2A agar  :

وهذا الوسط يصلح لكل من pour plate count  ,spread plate count , membrane filter count

الطرق الأكثر شهرة المستخدمة فى عد البكتيريا غير ذاتية التغذية:

1)طريقة pour plate

·        الوسط المستخدم pour count agar:    او R2A agar  

·        نستخدم التخفيف الملائم لتكوين من 30-300 مستعمرة.  ومن كل عينة نحضر  طبقين

·        ناخذ 1 مل من العينة (نضع الماصة اسفل سطح العينة  بـ2.5 سم)ونضعه فى الطبق (يجب أن نفتح جزأى الطبق فتحة صغيرة ونضع من بينها الماصة  ونغلق بسرعة  حتى لا يحدث تلوث بالبكتريا الموجودة فى الهواء ) ثم نصب الآجار فى الطبق  ونحرك الطبق حركة دائرية فى مستوى واحد حتى يتوزع الوسط الغذائى على كل العينة ( من غير رج) الى ان يتصلب الآجار  ثم نقلب الطبق ونضعه فى الحضانة على درجة حرارة  35 م ولمد 48 ساعة.

·        نجهز عينة blank   وذلك لنتأكد من خلو الوسط الغذائى – الآجار- من أى نوع من البكتيريا

·        نسجل التاريخ ونوع العينة والقائم بالتحضير  وساعة التحضير.

 عملية العد:

      تظهر مستعمرات البكتيريا  بيضاء مصفرة

·        لو قررنا تأجيل عملية العد يمكن أن نحفظ الطبق بعد استخراه من الحضانة فى درجة حرارة 5-10 م لمدة لاتزيد عن 24 ساعة

·        قانون العد :

·         

c.f.u /ml =colonies counted /actual volume of sample

وبما أننا أخنا 1 مل من العينة  سيكون c.fu=/ml = colonies counted

·        ناخذ فى الإعتبار معامل التخفيف

·        لو كانت كمية المستعمرات فى الطبق كبيرة  نقسمه ونعد جزء ونضرب فى عامل القسمة

·        لو كانت العدد كبير جدا بحيث يصعب عده  نعيد التجربة بتخفيف أكثر ونحسب معامل التخفيف

2)membrane filter method 

الوسط المستخدم R2A agar  :

·        قطر الغشاء لا يزيد عن 0.45 µm

·        ناخذ 1 مل من العينة ونضعه فى كمية ماء مقطر معقمة  ثم نصبه على الغشاء حتى يتم توزيع العينة على مساحة الغشاء  ثم نرفع الغشاء برفق بواسطة آداة معقمة

·        نكون قد جهزنا مسبقا طبق وفيه الوسط المغذى (الآجار R2A المتصلب)

·        نقلب الطبق ونضعه فى الحضانة على درجة حرارة 35 لمدة 48 ساعة أو أكثر قليلا أو على درجة حرارة  20-28  لمدة 5-7 ايام

·        طريقة العد مثل طريقة pour plate

طريقة العد الكلي للبكتريا القولونية باستخدام الترشيح الغشائي Total coliform (membrane filter method...)

الوسط المستخدم M-Endo Agar
نجهز وحدة الترشيح وذلك بتعقيمها بواسطة الماء الساخن او كحول 
يجب ان يكون الجو العام في حجرة الزرع في حالة كبيرة من التعقيم
نحضر ورقة ترشيح (عادة تكون مغلفة بواسطة المصنع) ونضعها في المكان المخصص في وحدة الترشيح
نأخذ 100 مللي من العينة  ونضعها في الوعاء الخاص بوحدة الترشيح  ونقوم بالترشيح  
يجب الا تزيد عكارة المياه عن 5 وحدة عكارة NTU
بواسطة ماسك معقم  نأخذ ورقة الترشيح ونضعها برفق علي سطح الأجار المتصلب (M-Endo agar) المحضر مسبقا 
(5 -7 مللي في الطبق الصغير )  بحيث لايكون هناك اى فراغات
نصبر فترة قصيرة حتي تتلامس الورقة جيدا  بالوسط الغذائي ويظهر ذلك بتلون ورقة الترشيح من الخلف باللون الاحمر 
نقلب الطبق ونضعه في الحضانة عند 35.5 درجة ولمدة 24 ساعة والنتيجة النهائية بعد 48 ساعة من الزرع 

قلنون العد

(total) Coliform colonies/100mL = (coliform colonies counted x 100) / (mL sample filtered

طريقة عد البكتريا القولونية البرازية بطريقة الترشيح الغشائي fecal coliform 
نفس الخطوات السابقة وقانون العد فيما عدا
1-نستخدم وسط غذاء FC agar 
2-التحضين عند 44.5 درجة لمدة 24 ساعة

*تقنية العد الكلى للبكتيريا القولونية (التخمر)multiple tubes 

الكشف عن المجموعة القولونية :

تستخدم هذه الطريقة للكشف عن كل أنواع البكتيريا التى تستطيع تخمير اللا كتوز  فى تحضين 35 م لمدة 48 ساعة

فى هذه الطريقة أثر وجود البكتيريا سيظهر على صورة وجود غاز(co2   ) او تغير      

 فى  الـ  PH –تزيد الحامضية- يمكن أن نستخدم 0.01 g   من  bromocresol  purple    كدليل

سنسمى العينة التى يثبت وجود اى بكتيريا بها بأنها  عينة موجبة  +ve

والعينة السالبة    -ve هى التى لا يتواجد بها اى أثار البكتيريا من الغاز او الحامضية

الوسط المستخدم laryl broth

طريقة التحضير :

تعتمد طريقة التحضير على عدد الملليمترات المضافة من العينة او التخفيف

فعندما نضع 1 مللى من العينة سنضيف 10 مللى من اللوريل  (35.6 جم من اللوريل فى اللتر)

وعندما نضع 10 مللى من العينة سنضيف 10 مللى من اللوريل ( جم 71.2 من اللوريل فى اللتر)

يمكن الكشف عن المجموعة القولونية  بطريقتين

1)    تقنية التخمر بواسطة الانابيب المتعددة  او ما يسمى بتجربة الوجود والغياب  ( وذلك من خلال الاطوار  الفتراضى والتكميلى والتاكيدى )

2)    المرشح الغشائى 

3)    انتاج الأساس  الإنزيمى    

  

اولا فى حالة المياه المرشحة

نأخذ 100 مل من العينة  أو 5 أنابيب كل واحدة 20 ملل او 10 أنابيب كل واحدة تحتوى على 10 مل 

 1 الوسط الإفتراضى :

 

نستخدم اللوريل بروس كوسط غذائى  

الجدول الآتى يوضح العلاقة بين كمية الوسط الغذائى وكمية العينة

عينة المياة	كمية الوسط المضاف اليها بالـ مل	الوزنة المستخدمة فى تحضير الوسط فى اللتر
100	50	106.8 جم
	35	137.1 جم
20	10	106.8 جم
10	10	71.2

والجدول التالى يوضح طريقة العدد عندما نستخدم  10 أنابيب كل انبوبة 10 مل  وعدد الأنابيب الموجبة

 

وهذا الجدول فى حالة استخدام 5 انابيب 20 ما مكن المياه المرشحة

 

ثانيا:  فى حالة المياه الغيرمرشحة أو العكرة

نأخذ ثلاثة صفوف من التخفبفات  كل صف يحتوى على 5 انابيب

           1:10                    1:100                  1:1000

  

كل أنبوبة تحتوى على 1 مللى من التخفيف + 10 من اللوريل

او ما يقتضيه التخفيف

ترص الأنابيب على حسب ترتيبها وتوضع فى الحضانة على 35 م لمدة 24 ساعة  ثم ننظر ونسجل الملاحظات والنتيجة النهائية بعد  48 ساعة 

التجربة التأكيدية:

سنستخدم brilliant green lactose bile broth   كوسط غذائى

العينة التى سيثبت بها وجود بكتريا فى طريقة اللوريل  سنخضعها للفحص بواسطة

 Brilliant green lactose bile broth  

نعقم ساق زجاجى والأفضل عن طريق اللهب ونغمسه بحيث ينطفأ على السطح العلوى لعينة اللوريل  حتى نتأكد أنه لم يأخذ أى بكتريا الا من عينة اللوريل ثم نغمسه فى العينة  ونخرجه ونضعه فى الوسط التأكيدى   Brilliant green lactose bile broth    

 أو نرج انبوبة اللوريل ثم نأخذ الغطاء الخاص بها  ونقفل به انبوبة  الوسطة التأكيدى نقلب الانبوبة عدة مرات حتى يتوزع اثر العينة على جميع الوسط 

نضعه فى الحضانه على 35 م لمدة 24 ساعة وللتأكيد 48 ساعة

تجربة التفريق بين البكتريا القولونية البرازية وغير البرازية:

نأخذ العينات الموجبة +ve  (التى ثبت بها وجود بكتريا) فى تجربة اللوريل ونأخذ منها أثر

كما فعلنا فى التجربة التأكيدية السابقة  وسوف  نستخدم الوسط الغذائى EC –broth   لنتعرف على وجود البكتريا القولونية البرازية  fecal Coliform  على 44.5 م ولمدة 24 ساعة 

إذا ثبت وجود البكتريا فهى بكتريا قولونية برازية

إما إذا تأكدنا من وجود البكتريا فى Brilliant green lactose bile broth   اى كانت العينة+ve   وكانت –ve   فى EC broth  اى لم يثبت وجود البكتريا 

فإنه فى هذه الحالة تكون البكتريا قولونية غير برازية non fecal Coliform

والتخطيط التالى يوضح أكثر:

وهذا الجدول يوضح طريقة العد عند استخدام 5 انابيب لكل تخفيف

 

 

.

ويكون الحساب من خلال القانون التالى

                              

لمزيد من المعلومات 

اشترك هنـــــــــــا